Préparation immunohistochimique sur coupes ultra-fines


L’immunohistochimie sur coupes ultra-fines est une technique qui permet de détecter une protéine d’intérêt, grâce à un anticorps couplé à une bille d’or. Les coupes sont observées au microscope électronique à transmission, ce qui rend la localisation de la protéine très précise.

Pour ce type de préparation, il est nécessaire de prélever des échantillons d’environ 1mm3 et de les incuber dans le fixateur (paraformaldéhyde 3% dans du tampon phosphate 0,1M pH 7.4). Ces prélèvements doivent être maintenus à +4°C jusqu’à leur arrivée au laboratoire.

Les échantillons sont déshydratés dans l’éthanol à des concentrations croissantes (de 30% jusqu’à l’éthanol absolu).

Nous réaliserons ensuite une inclusion en résine Unicryl. La résine est polymérisée à +4°C sous U.V.

unicrylVue d’un bloc d’inclusion en résine Unicryl

En premier lieu, des coupes semi-fines d’environ 2µm d’épaisseur sont déposées sur lame de verre, colorées au bleu de toluidine et observées au microscope optique.

La zone d’intérêt est identifiée sur la coupe semi-fine et une coupe ultra-fine d’environ 80nm d’épaisseur sera réalisée grâce à un couteau de diamant. Les coupes sont ensuite récupérées sur une grille de nickel recouverte d’un film de carbone.

grille niVue d’une grille de nickel recouverte d’un film de carbone

La reconnaissance antigène / anticorps est réalisée sur les coupes. L’anticorps secondaire (Ted Pella) est couplé à une bille d’or de tailles comprises entre 5 et 25 nm.

Enfin, les coupes sont contrastées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb.